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qPCR引物设计及相关注意事项 & 设计转录本特异性引物
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1. 引物跨内含子设计 在设计qPCR引物时,选择跨内含子设计的引物可以使gDNA模板不能得到扩增,产物均来源于cDNA的扩增,这样也就去除了gDNA污染造成的影响。 2. 引物长度 引物长度一般在18~30 nt之间,扩增产物长度尽量控制在 100~300 bp之间。 引物设计太短会导致非特异扩增,太长则容易形成二级结构(如发夹结构)。扩增产物太长不适于聚合酶进行反应,会影响到PCR扩增效率。 3. GC含量和Tm值 引物GC含量控制在40%~60%之间,过高或过低都不利于引发反应。正反向引物GC含量应接近相同,以便获得相同的 Tm值和退火温度。 Tm值应尽量在55~65℃之间,一般为60℃左右,上下游的Tm值应尽量姐接近,最好不超过4℃ 真核生物基因断裂基因、可变剪切产生多个转录本 有人指出从共有序列区域设计,但是实际发挥特定功能的转录本通过只有一个,因此,基于共有序列的检测结果并不代表功能蛋白转录本的水平,这有可能造成mRNA水平和蛋白水平检测的偏差。 并且对于不同的转录本,其表达也会有差异,甚至相反,因此,基于共有序列设计引物值得商榷 确定自己研究基因的功能转录本 设计转录本特异性引物 针对目的基因cDNA不同位置设计引物进行检测
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