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CRISPR-cas9简要原理及基于Lenticrispr V2质粒构建基因敲除质粒
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CRISPR-Cas9系统是目前最流行的基因组编辑技术,可以实现目的基因的敲除、插入和突变,该技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶基因定性修饰技术。科学家为了让Cas蛋白定向剪切DNA序列,在CRISPR工作机理的基础上,人为重组了一段目的基因的sgRNA(small-guide RNA),在sgRNA的引导下,Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割。本文主要介绍,目的基因sgRNA设计和如何将sgRNA构建到CRISPR-Cas相关载体。 并简单介绍了DNA双链断裂的修复机制,这是CRISPR-cas9的基础: HDR同源重组修复 (Homology directed repair ): 是在两个相似或相同的DNA分子核苷酸序列之间交换的一种遗传重组,并且在断端不会出现核苷酸缺失或增加,能精确地修复DNA双链的断裂。 NHEJ经典通路的DSB修复,断端会经过核酸酶的修剪和DNA聚合酶的填平空隙,所以DSB修复的DNA会有“伤痕”,可能是修复合成时新加入几个核苷酸或切除一些核苷酸;因此,在损伤末端重连处,一般会有几个核苷酸或几对碱基对的“伤痕”。
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